Harvinainen geeniperimä auttaa löytämään yleisiä tauteja ohjaavia mekanismeja

Pohjoissuomalainen väestö on geeniperimältään ainutlaatuinen. Harvinainen geeniperimä on mahdollistanut harvinaisten tautien tutkimisen sekä uusien geenien, proteiinien ja solun reaktioreittien löytämisen.

 

Oulun yliopiston lääketieteellisen solu- ja molekyylibiologian dosentti Reetta Hinttala yhdessä lastenneurologian professori Johanna Uusimaan kanssa löysivät NHLRC2-geenin mutaatioista aiheutuvan, lapsuusiällä ilmenevän vakavan monielintaudin. Vielä ei tiedetä mitä geenimutaation koodaama proteiini tarkalleen tekee soluissa, mutta se on tunnistettu elintärkeäksi alkionkehityksessä.

”Annoimme tälle taudille nimen FINCA (Fibrosis, Neurodegeneration, and Cerebral Angiomatosis) perustuen potilaiden kudoksissa havaittuihin päälöydöksiin. Tutkimuksemme tuloksena FINCA-potilailta löydettiin mutaatioita ensimmäistä kertaa NHLR2-geenistä”, kertoo Hinttala.

Reetta Hinttala tutkii Oulun yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan PEDEGO-tutkimusyksikössä lapsuusiän perinnöllisiä neurologisia sairauksia. Kyseisen tutkimuksen kohteena olleiden perheiden lapsilla havaittiin aiemmin kuvaamatonta sidekudosmuodostusta keuhkoissa, hermosolujen tuhoutumista sekä verisuonten uudismuodostusta aivoissa. Tauti ilmeni kahden kuukauden iässä ja se eteni nopeasti.

”Kyseessä oli uudentyyppinen tautioireisto, joten epäilimme, että kyseessä täytyy olla uusi tauti,” sanoo Reetta Hinttala.

Tutkituilta sekvensoitiin genomin proteiinia koodaavat alueet eli eksomi. Suurin osa tautia aiheuttavista muutoksista sijaitsee tämän hetkisen tiedon mukaan eksomissa joka kuitenkin kattaa vain noin 1,5 % perimästämme.

”Tuloksista paljastui muutoksia NHLRC2-geenin nukleotidijärjestyksessä. Kyseistä geeniä tai sen muutoksia ei oltu aiemmin liitetty mihinkään tautiin tai ylipäätään kuvattu tieteellisissä julkaisuissa. Aloimme siis tutkia tämän geenin koodaavaa proteiinia ja erityisesti sitä mitä se tekee solussa.”

Hiirimalli apuun

Kun halutaan selvittää, miten tauti syntyy ja kehittyy ihmisessä, ainoa vaihtoehto on tutkia sitä elävässä organismissa. Vain siten voidaan seurata, mitä tautia aiheuttava proteiini tekee elimistössä. Nyt luotiin hiirimalli, jossa on sama mutaatioyhdistelmä kuin potilailla. Knock-out hiiri, jossa NHLRC2-geeni on kytketty kokonaan pois päältä, hankittiin Infrafrontier-infrastruktuurin EMMA –pankista. EMMA (The European Mouse Mutant Archive) arkistoi geenimuunneltuja hiirikantoja eri puolilta maailmaa. Tämän lisäksi Hinttala ryhmineen loi CRISPR-Cas9 -tekniikalla hiireen FINCA-potilailta löytyneen pistemutaation. Risteyttämällä pistemutaatiota kantava hiiri knock-out hiiren kanssa saatiin mallijoka ilmentää FINCA-potilaiden mutaatioyhdistelmää.

”Kartoitamme hiirimallimme avulla NHLRC2:n roolia erityisesti keskushermoston kehityksessä Suomen Akatemian rahoittamassa projektissa. Kudostasolla olemme saaneet rohkaisevia viitteitä FINCA-tautiin liittyvistä muutoksista myös hiirellä, mutta ilmiasun kokonaisvaltainen kartoittaminen vie vielä aikaa.”

Tautigeenin toiminnan häiriöstä aiheutuvia solutason muutoksia tutkittiin potilaiden fibroblasteista Biocenter Oulun Elektronimikroskooppi-yksikön läpäisyelektronimikroskoopilla. Fibroblasti on sidekudoksen perussolu, joka tuottaa ympäröivän sidekudoksen soluväliaineen.

”Ensimmäiseksi viitteitä löydetyn muutoksen eli variantin haitallisuudesta antaa tieto, muuttaako variantti proteiinin aminohappokoodia. Tutkittavien tapauksessa NHLRC2-geenin mutaatiot muuttivat koodia. Potilaiden viljellyistä ihosoluista tarkistimme myös NHLRC2-proteiinin ilmentymisen. Terveiden ihmisten ihosoluissa NHLRC2 -proteiinia ilmeni normaalisti kun taas tutkittavilla proteiini oli mutaatioiden johdosta lähestulkoon hävinnyt kokonaan. Tämä viittaa siihen, että mutaatiot muuttavat NHLRC2- proteiinin rakennetta niin paljon, että solu pyrkii hajottamaan haitallisen proteiinin kokonaan. Näin pystyimme varmistamaan, että kyseessä ei siis ollut neutraali variantti.”

Tehdyssä tutkimuksessa löydettiin siis uusi normaalille sikiönkehitykselle välttämätön geeni. Tutkijat tulivat siihen tulokseen, että geeni on elintärkeä soluille jo ensimmäisten solunjakautumisten aikana hiirellä. FINCA -potilaiden löydökset osoittivat myös NHLRC2-proteiinin tärkeän roolin useiden elinten toimintojen ylläpidolle ihmisellä.

Solujen viestintäreitit antavat arvokasta tietoa

Harvinaisten tautien tutkiminen voi johtaa myös yleisten tautien syiden paikantamiseen sellaisiin proteiineihin, joiden toimintaa ei ole aikaisemmin tunnettu.

”Tutkimalla harvinaista tautia on suuri todennäköisyys selvittää reaktioreittejä, joilla on rooli myös yleisimpien tautien taustalla.”

Solun toiminta perustuu biokemiallisille reaktioille. Reaktiot kytkeytyvät päälle tai pois riippuen solun toiminnasta. Solut muuttavat toimintaansa ympäristöstä saapuvien viestien mukaisesti. Kun esimerkiksi hormoni sitoutuu solun pinnalla olevaan reseptoriin, reseptori aktivoi jonkin solun sisällä olevan molekyylin, joka kuljettaa signaalia eteenpäin. Usein signaali päätyy tumaan säätelemään geenien toimintaa. Erilaisia signalointireittejä on suuri määrä. Esimerkiksi syöpäsolut eivät reagoi moniin niille tarkoitettuihin viesteihin. Sen sijaan syöpäsolut vahvistavat signalointireittejä, jotka aiheuttavat solun jakautumista ja siis kasvaimen kasvua.

NHLRC2-proteiinilla on vaikutusta monissa solujen reaktioreiteissä ja tapahtumissa. Tutkijat pystyivät ensimmäistä kertaa osoittamaan, että NHLRC2:n toiminnan häiriö johtaa solujen tukirangan muutoksiin sekä solunsisäisten kalvorakkuloiden muodostumiseen. Tukirangalla on tärkeä rooli useissa solun eri toiminnoissa, sitä ilman solu ei ole elinkykyinen.

Hinttalan mukaan harvinaisia tauteja tutkimalla voidaankin tehdä löytöjä, joilla on merkitystä myös perussolubiologialle. Kallisarvoista on myös tieto geenin ja proteiinin toiminnanhäiriön yhteydestä ilmiasuun ihmisellä.

”FINCA-taudissa NHLRC2-proteiinin toiminnanhäiriö johtaa vakavaan kudosfibroosiin sekä hermosolujen tuhoutumiseen. Myös yleisemmin ilmenevissä taudeissa, kuten esim. maksakirroosissa sekä Alzheimerin taudissa, havaitaan samantyyppisiä kudosmanifestaatioita.”

Hinttalan mukaan harvinaista tautia tutkimalla on suuri todennäköisyys selvittää niitä reaktioreittejä, jotka ovat myös yleisempien tautien taustalla.

”Lapsuusiällä ilmenevien vakavien tautien taustalla on harvoin kyseessä ympäristötekijät joiden rooli vaikeuttaa aikuisiällä ilmaantuvien tautien syntysyiden ja mekanismien tutkimista. Tutkimuksemme kohteena olevat taudit ovat hyvin todennäköisesti perinnöllisiä ja aiheutuvat ensisijaisesti geenien toimintahäiriöstä.”

Ari Turunen

4.7.2019

Lue artikkeli PDF-muodossa

Sitaatti

Ari Turunen, Reetta Hinttala, & Tommi Nyrönen. (2019). Research on rare genetic disorders can be utilised in understanding the mechanisms behind even more common diseases. https://doi.org/10.5281/zenodo.8131030

Hiirimalleista apua ihmisten tautien syntymekanismien selvittämiseen

Pienet erot perimässämme tekevät meistä erilaisia. Monimuotoisuus on hyvä asia, mutta toisinaan geenimuutokset aiheuttavat sairauksia. Hiiret ovat ihmisen sairauksien tutkimiselle hyvä apu, sillä hiiren ja ihmisen genomi on noin 80 prosenttisesti samankaltainen. Hiirikannoista voidaan siksi luoda ihmisen geneettisten tautien malleja, ja näitä malleja voidaan käyttää tautien syntymekanismien tutkimuksessa ja lääkeainesuunnittelussa.

Eurooppalainen INFRAFRONTIER-tutkimusinfrastruktuuri tarjoaa yli 6800 erilaista hiirikannan mutaatiota eli käytännössä tuhansien eri sairauksien hiirikantoja. Infrastruktuurissa on 23 jäsenorganisaatiota. Suomea edustaa Oulun yliopistossa toimiva Biocenter Oulu.

Vuonna 2007 lääketieteen ja fysiologian Nobelin palkinnot myönnettiin Mario Capecchille, Olivier Smithiesille ja Martin Evansille tutkimuksesta, jonka ansiosta kantasolujen avulla voidaan luoda muutoksia ja lisäyksiä hiiren omaan, nk. ituradan eli perimän kautta tulevaan genomiin. Evans kehitti menetelmän kasvattaa hiiren alkion kantasoluja. Hän lisäsi kantasoluja hiiren alkioon ja kehittyi hiiriä, joiden soluista osa oli viljeltyjä kantasoluja. Toisin sanoen hiiren perimään saatiin liitettyä kantasolujen avulla toisen hiiren geneettistä materiaalia. Solutasolla hybridit hiiret kehittyivät normaalisti.

Capecchi ja Smithies kehittivät puolestaan menetelmän häiritä tai kokonaan sammuttaa hiiren tietyn geenin ilmentyminen siirtämällä vierasta DNA:ta hiiren kromosomistoon tarkasti määriteltyihin kohtiin. Vieras DNA lopettaa tai merkittäviltä osin sammuttaa geenin toiminnan, jolloin voidaan tutkia mikä geeni vaikuttaa mihinkin hiiren ominaisuuteen. Kohdennettua geenin toiminnan estämistä käytettiin hiiren alkion kantasoluihin. Niiden avulla voitiin kasvattaa hiiri, jonka jälkeläiset olivat kokonaan ns. poistogeenisiä eli niiden perimästä oli poistettu toiminnasta jokin geeni. Tämän tekniikan on nykyään korvannut suurelta osin CRISPR-Cas9- menetelmä.

Koska hiiren yksittäisen geenin toiminta voidaan sammuttaa, pystytään nyt tutkimaan, minkä vaikutuksen kyseisen geenin poiskytkeminen aiheuttaa. Näin on voitu esimerkiksi määrittää geenejä , jotka ohjaavat nisäkkäiden luuston ja tiettyjen sisäelinten kehitystä.

Hiirimallit tautien mekanismien tutkimisessa

Geenien toiminnan säätelymenetelmien ansiosta on voitu tehdä hiirimalleja useista ihmisten sairauksista. Näitä hiirimalleja voidaan käyttää tutkittaessa tautien syntymekanismeja, niiden etenemistä ja luonnollisesti myös hoitoa.

”Jos potilaalta löydetään uusi mutaatio ja tauti, me näemme vain taudin lääketieteellisesti luokitellun ilmentymän. On vaikea erottaa, mikä on ensisijainen syy taudin syntyyn tai mikä on toissijainen seuraus, jos kyseessä on pitkälle edennyt tai monielinoireinen tauti,” sanoo dosentti Reetta Hinttala Biocenter Oulusta.

Hinttala on Biocenter Oulun Transgeeniyksikön koordinaattori. Yksikkö on osa eurooppalaista INFRAFRONTIER-infrastruktuuria. IINFAFRONTIER tarjoaa tutkijoille maailmanlaajuisesti pääsyn hiirimalleihin, jotka liittyvät geeniperimän ja sairauksiin tutkimiseen.

Reetta Hinttala tutkii Oulun yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan PEDEGO-tutkimusyksikössä hiirimallien avulla mm. harvinaisia perinnöllisiä sairauksia. Hiirimallit auttavat tunnistamaan tautia aiheuttavat geenit.

”Hiirimallit ovat olennainen osa geenitutkimusta. Niiden avulla pystytään selvittämään organismin tasolla tautigeeniä ja tautimekanismeja. Malli tuo perustietoa siitä, miten tauti etenee. Tutkimalla eri ikäisiä hiiriä saadaan tietoa, mitä eri kudoksissa tapahtuu taudin eri vaiheissa.”

Hinttalan mukaan vastaavanlaista kudostason analyysiä olisi vaikea toteuttaa potilasaineistosta, varsinkin jos kyseessä ovat keskushermostoon vaikuttavat taudit.

”Eläinmalli tuo arvokasta tietoa tapahtumista kudostasolla aivan taudin alkuvaiheessa. Ne voivat olla sellaisia tapahtumia, joita ei välttämättä ihmisellä ole huomattukaan. Kohdentamalla tutkimukset juuri niihin alkuvaiheen muutoksiin on mahdollista löytää taudin varhaiseen vaiheeseen kohdentuvia hoitokeinoja, joita voidaan hyödyntää jatkossa lääkeainekehittelyssä.”

Hiirimallin merkitys tautigenetiikan tutkimukselle on Hinttalan mielestä erityisen arvokasta silloin, kun tutkitaan tuntematonta proteiinia ja taudin mekanismia. Sen avulla päästään tutkimaan oikeassa ympäristössä, mitä kudoksissa taudin edetessä tapahtuu. Koska hiiren ja ihmisen perimä on hyvin samankaltainen, voidaan samoja fundamentaalisia tautia aiheuttavia mekanismeja havaita sekä hiiressä että ihmisessä.

Kudosten kuvantaminen vaatii tallennustilaa

Kudokset rakentuvat soluista ja niitä ympäröivästä soluväliaineesta. Oulussa tutkitaan kudosten rakennetta sekä sitä, miten kudokset järjestyvät muodostaakseen elimiä. Keskeinen apuväline kudosdatan keräämisessä on mikroskooppi, jolla voidaan kuvantaa kudosten rakennetta. Kudosnäytteistä saadaan lisäinformaatiota käyttämällä erilaisia värjäystekniikoita haluttujen rakenteiden osoittamiseksi. Värjäyksissä voidaan käyttää väriaineita, jotka sitoutuvat vain tiettyihin rakenteisiin ja molekyyleihin.

Kuvannetut digitaaliset kudosnäytteet varustetaan metadatalla ja arkistoidaan. Haasteena on kuitenkin kuvannetun datan säilyttäminen ja jakaminen. Slide Scanner- laitteen skannaaman kudosleikkeen kuvatiedoston koko voi jopa nousta kymmeniin gigatavuihin. Haasteena on, miten näitä tiedostoja hallinnoidaan tulevaisuudessa.

Tutkijoilla on suuri tarve säilyttää kuvamateriaali. Data pitää kuitenkin osata kuvailla, jotta se voidaan jakaa tiedeyhteisölle.

”Sekä INFRAFONTIER että ELIXIR-infrastruktuurit tekevät töitä avoimen tutkimustiedon saatavuuden eteen. Jotta esimerkiksi hiiristä tuotettu data olisi maksimaalisesti hyödynnettävissä, se pitää saada käsiteltyä ja analysoitua tutkimusta hyödyntävällä tavalla. Tärkeänä työsarkana pidän myös kuvailua kansainvälisiä standardeja käyttäen, mikä tekee jatkokäytön mahdolliseksi, esimerkkinä tiedon yhdistely täydentäviin tietolähteisiin,” sanoo Tommi Nyrönen, Suomen ELIXIR-keskukseen johtaja CSC:stä.

EMMA on hiirimallien laaja arkisto

Tieteellisesti merkittävät hiirikannat ovat Euroopassa INFRAFRONTIERin EMMA-arkistossa, joka on yksi maailman johtavista hiirikantojen arkistoista. EMMA (The European Mutant Mouse Archive) arkistoi geenimuunneltuja hiirikantoja eri puolilta maailmaa ilmaiseksi. EMMA:ssa on tällä hetkellä 6800 mutatoitua hiirikantaa eli hiirimallia ja moni näistä hiirimalleista on voitu yhdistää sairauksiin. Münchenissa olevan keskuksen kautta organisoidaan INFRAFRONTIERin eri yksiköiden toimintaa. 12 eri maassa olevien yksiköiden tehtävänä on hiirikantojen pakastaminen, säilytys ja jakelu. Osa tekee myös fenotyypitystä.

”Tutkija voi halutessaan säilöä oman hiirikantansa, hiirimallinsa arkistoon, jos hiirikanta on tarpeeksi hyvin karakterisoitu ja tietty mutaatio hiiressä on luotettavasti todennettu. Kun uusi hiirikanta otetaan EMMA-arkistoon, tutkija lähettää hiiret valittuun yksikköön. INFRAFRONTIERin www-sivuilla on hakupalvelu, josta selviää, mitä hiirikantoja on tällä hetkellä säilytettynä. Pakastettu kanta voidaan myöhemmin elvyttää eläviksi hiiriksi.”

Suomen EMMA-yksikössä Oulussa on arkistoituna 226 eri hiirikantaa. Yksi näistä on Reetta Hinttalan ja lastenneurologian professori Johanna Uusimaan löytämän harvinaisen FINCA-taudin hiirimalli. Siinä tautia aiheuttava NHLRC2- geenin toiminta on sammutettu. Aiemmin toiminnaltaan tuntemattoman NHLRC2-proteiinin on havaittu olevan elintärkeä normaalille sikiönkehitykselle sekä useiden elinten toiminnoille.

Fenotyypitys kuvaa hiirimallin

Hiiren oireiden ja muiden ominaisuuksien perusteella tehdään hiiren ilmiasun eli fenotyypin luokitus. Geenimuuntelun vaikutukset hiiren ilmiasuun selvitetään systemaattisten analyysien avulla. Näin ne kuvaavat kyseisen hiirimallin.

”Näitä analyysejä tehdään ns. hiiriklinikoissa, joissa genotyypin ja fenotyypin välisiä vuorovaikutuksia selvitetään käyttämällä kehittyneitä analyysi- ja diagnostiikkatekniikoita,” Hinttala kertoo.

Tutkijoilla on INFRAFRONTIERin kautta pääsy niin Saksan hiiriklinikkaan (German Mouse Clinic) kuin myös mahdollisuus hyödyntää maailmanlaajuisen hiiren fenotyypitystä tekevän konsortiumin IMPC:n palveluja. IMPC (International Mouse Phenotyping Consortium) selvittää tautimekanismia malleissa, joissa yksi hiiren noin 20 000 geenistä on poistettu.

Fenotyypitys tarvitsee myös kansallisen tason toimintaa. Reetta Hinttala on Biokeskus Suomen FinGMice-verkoston puheenjohtaja. Biokeskus Suomen neljä paikkakuntaa (Helsinki, Turku, Kuopio ja Oulu) rakentavat yhdessä kattavaa ja monipuolista hiiren fenotyypitysverkostoa.

”Tavoitteena on taata tutkijoille palvelua, laitteistoa sekä analysointiapua perustason sekä myös erityistason osaamista vaativiin fenotyypityksiin. Erityisen tärkeää on myös siirtää esimerkiksi isoja kuvatiedostoja kudosleikkeistä eri yliopistojen välillä, jolloin saamme tarvittaessa konsultointiapua eri puolilla Suomea olevilta asiantuntijoilta.”

Ari Turunen

23.4.2019

Lue artikkeli PDF-muodossa

Sitaatti

Ari Turunen, Reetta Hintala, & Tommi Nyrönen. (2019). Mouse models provide insights into the causal mechanisms of diseases. https://doi.org/10.5281/zenodo.8118927